支原体污染一般会呈现细胞状态变差、生长变慢，在显微镜下观察可能会有小黑点，但培养基一般不浑浊，细胞传代以后就出现细胞间黑点、细胞空泡化或者很多类似凋亡、坏死的细胞，最终细胞漂浮，完全死亡。

支原体污染需要实验室及培养箱进行灭菌处理，实验室环境可采用84消毒以及臭氧，培养箱用酒精进行擦拭后再使用，再有就是操作及使用的耗材，像移液枪及移液管在使用上需要注意。

建议细胞使用3个月后更换（传代20次左右），不断利用同一株细胞，细胞会不断衰老，对实验效果不佳。

此现象是正常的，细胞可能处于分裂阶段，会出现呈葡萄的黏连现象，若细胞出现致密的球状结团，则细胞活率可能会下降，注意检查各培养条件是否正常，如摇床转数是否过高，细胞传代是否不及时等。

一般培养基中大多数使用HCO₃^-/CO₃^2-/H⁺作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO₃的含量决定细胞培养时CO₂的浓度。当培养基中NaHCO₃含量为每公升3.7g时，采用10%CO₂；培养基中NaHCO₃含量为每公升1.5g时采用5%CO₂。

若使用珠海恺瑞的冻存液KD-Freeze，解冻复苏时无需离心去除DMSO；

若使用自配的冻存液，可离心去除DMSO再进行用新鲜培养液重悬细胞；或直接培养在新鲜培养液中，待隔天置换新鲜培养液以去除DMSO（可避免大部分解冻后细胞无法生长或离心对细胞造成物理性伤害以及细胞流失）。

细胞复苏不起来时首先要检查培养件是否有误，如温度37℃；湿度稳定；摇床转速120rpm(振幅为26mm，若振幅为50mm，则换算转速为85-90rpm)；其次，细胞冻存时的状态是否稳定；或复苏时水浴温度距37℃上下差距较大或水浴时间过长，另外冻存时间过长对细胞也有一定的损伤，冻存液中的成分对细胞生长也有较轻的抑制效果。

出现复苏1-2代细胞活率逐渐下降，此时可以先把细胞转至方瓶放置静止培养箱，再观察状态；待细胞状态回复后，重新转摇瓶培养。

进行细胞种子保存时，请按说明书中推荐的细胞冻存密度将细胞离心，再加入珠海恺瑞自主研发的无血清细胞冻存液，而后依次放置于-80℃冰箱和液氮罐保存。细胞复苏时不需要对融化后的细胞进行离心除去细胞冻存液这一步操作，直接将细胞转移到小体积摇瓶进行悬浮培养，待细胞恢复三至四天后进行传代，细胞活率恢复后再进行后续实验，避免造成对后续实验的影响。

细胞传代培养时需要注意选择细胞的传代接种密度、传代时机以及密切关注细胞活率等事项。以珠海恺瑞驯化筛选的HEK293为例，此细胞生长周期为9-10天，传代时细胞接种密度为0.3-0.5×106个/毫升，细胞传代时期是细胞正处于指数增长期，此时细胞活率应在98%以上，细胞密度为4-6×106个/毫升（即培养三到四天进行传代）。传代培养过程中要密切注意细胞的活率状态，若活率下降，需先检查各个培养条件是否发生了变化，若无，则对细胞进行离心处理，在小体积摇瓶中传代培养，待细胞状态恢复后再进行下一步实验。

珠海恺瑞开发的无血清化学限定培养液采用自主研发配方，且不含抗结团剂及其它蛋白添加因子，所提供的细胞生长环境与其它品牌产品明显不同，因此在更换培养液时细胞容易出现短暂的不适应现象。用户在更换使用珠海恺瑞培养液时若出现上述现象，可将新、旧培养液混合后使用并逐步减低原来培养液体积比例，待细胞过渡到新培养液后，让细胞在新的培养液中持续传代数周时间，等细胞的生长速度及密度恢复至正常状态再做下一步的实验。在此期间，我们会安排技术人员及时解答用户所遇到的问题，确保细胞培养的成功。

不需要，珠海恺瑞开发的无血清细胞培养基系列均不需要提前预热，4℃冰箱中取出即可直接使用，不会对细胞造成损害导致大面积死亡。

不可以进行紫外照射，在紫外照射下，部分营养添加剂/细胞因子中蛋白成分会出现结构改变，降低使用效果或对细胞产生毒性；培养基经紫外线照射，其中营养成分可能发生改变，如某些氨基酸发生化学活化，对细胞产生毒性，影响细胞正常生长。

若转染后出现松散的细胞结团现象，可能是细胞成团粘附于瓶壁上并在震动中脱落下来所致，这种情况多数是摇瓶本身不干净或细胞存活率低而引起。在转染后，若转染后细胞结团现象比较严重，可在转染1天后加入适量抗结团剂（例如25mg/L左右的硫酸葡聚糖），以缓解或消除细胞结团。

因本系统使用的方法为高细胞密度转染，在20×10⁶个/ml密度条件下培养可能会出现轻微挂壁情况，这属于正常情况，可继续进行下一步操作。

质粒提取一般选择无内毒素的大提试剂盒，内毒素的含量越低越好，恺瑞非定制的培养基KOP293内毒素含量低于10EU/ml。

质粒浓度我们建议在1mg/ml，如果转染密度在2x10⁶个/ml，这个质粒浓度量是足够的，如果用户提高转染密度，对应的也可以适当调整质粒及转染试剂比例。常规转染可按照我们推荐的浓度即可。超螺旋比例越高越好。

通常表达峰值在3-4天，这个期间如果细胞活率下降会很大影响得率，最优的收样条件在5-6天左右，活率在70-80%。

正常，收样时的颜色差异主要与pH有关，导致这种的原因，主要还是要看当时的细胞状态，细胞状态不好就有可能偏酸，就算转染同一个质粒同一个细胞也会有这种情况发生；与质粒也有关系。

根据不同质粒的表达水平不同，293表达量大概在1-600mg/L，CHO表达量大概在1-400mg/L；在质粒同等表达水平下，建议使用293系统表达；若在293系统表达下，表达量相对较低，建议使用Hi-KDCHO高密度瞬转系统表达；Hi瞬转表达比正常CHO瞬转表达产量高10倍左右。

不是增强转染，是增强蛋白表达。主要作用是延缓细胞分裂，抑制细胞快速生长，从而促进蛋白表达、增加蛋白产量。

KT-Feed对CHO及HEK293细胞都适用，是一种植物蛋白营养添加剂，可补充细胞所需营养提高细胞表达量；据本公司的实验结果显示：添加KT-Feed能提高1/3-1倍的表达量，但由于蛋白表达结果受多方面的因素影响（z细胞生长状况、质粒表达水平等），具体增加的蛋白表达结果视实际情况而定。

转染试剂染的原理：不是脂质体转染，我们的转染系统是用阳离子聚合物转染的。

经多次验证，使用珠海恺瑞的293细胞瞬时转染系统，其最佳收样时间为转染后的第六天，但由于用户表达的蛋白大小及性质不尽相同，导致细胞转染后存活时间长短不一，因此收样时间应视情况而定，建议收样时细胞活率不要低于70%。

通常情况下细胞转染之后活率不会有太大的降低，若出现细胞活率急剧下降，首先检查培养条件是否有误，其次需检查所使用的转染试剂量是否过量，过量的转染试剂或者转染复合物都会导致活率下降。

也可以，但建议把sp2/0驯化至无血清再做小鼠融合，以便后续杂交瘤细胞驯化难降低。

杂交瘤细胞在1%FBS条件下传代1-2次，再进行降无血清。细胞在没完全适应低血清条件下生长，直接降无血清很难生长起来。

ITSplus与KD-HybriGro用途不同，ITSplus基础添加因子，主要应用于细胞无血清驯化及培养，在细胞克隆提高方面效果不明显，KD-HybriGro含重组白介素组合因子，可明显促进杂交瘤单细胞生长，配合1%FBS主要用于杂交瘤细胞单克隆培养，同时也可用于细胞驯化及融合培养。

KTM2是市面上1640、DMEM、IMDM基础培养基的基础上改良的低密度无血清培养液，营养成分上与它们区别较大，更适宜在方瓶中培养杂交瘤细胞；

KD-Clone是单细胞克隆培养液，营养成分比KTM2低，适合单细胞生长；适用于其他类型细胞克隆时的培养液。

KD-Hybri是高密度无血清培养液，营养成分比其他两种更复杂，适用于骨髓瘤/杂交瘤细胞生长。

ITSplus中含有骨髓瘤/杂交瘤细胞生长因子，但此因子稳定性欠佳，不能直接事先配入KD-Hybri中。所以KD-Hybri添加了ITS plus细胞才能生长，单独的KD-Hybri不能培养骨髓瘤/杂交瘤细胞。

细胞上摇瓶的原则是，先维持低浓度血清，不低于0.5×10⁶个/ml的密度上摇瓶，让细胞在初次上摇瓶时，仍保持对数生长速度，细胞密度增加，活率变化不大之后，再在摇瓶中逐步降血清，这样的成功率会比较高。

通常来说，可以直接用KD-Hybri代替DMEM，血清的浓度先维持不变，看细胞适应后，在开始逐步减血清。

在扩增培养转移细胞时，尽量在细胞生长状态良好且细胞汇合度达到80%左右进行，汇合度过高或过低均不利于细胞扩增。

细胞传代要及时并选择对数生长期进行传代。不同克隆的杂交瘤细胞生长速率不同，对无血清培养系统适应能力不同，最高生长密度也会有不同。

杂交瘤细胞稳定性较差，无血清持续驯化过程中可能会引起阳性细胞丢失，若遇到这种情况可通过对细胞进行多次单克隆以提高其阳性特性。

进行无血清驯化时必须保证细胞状态良好，细胞活率在85%以上时方可进行。切换成无血清培养后细胞一开始活率下降是细胞正在适应无血清环境的正常现象，此时需重点监测细胞后续是否有增殖、活率是否在逐渐回升。若细胞活率低于50%应补回2%血清，传代2-3代，待细胞状态恢复后再进行无血清驯化。

杂交瘤细胞一般可以直接从静置培养转换到摇瓶悬浮震荡培养，在此过程中细胞需要先通过静置培养逐级扩增，当细胞数量较多时再进行悬浮震荡培养。细胞接种到摇瓶时请将培养液切换成KD-Hybri，此时培养基血清含量可降至2%。